Pri la analizo de proteinoj el nutradologia vidpunkto

Ilona Emma Gál (Hungario)
Dr. fil., kandidatino de la kemiaj sciencoj, emerita sekciestrino, Budapeŝto.

1. Enkonduko

Al la plej gravaj problemoj de nia jarcento apartenas la fenomeno de monda malsato. Pro tio prezentiĝis la projekto, ke la ĉi-rilataj esploradoj kaj fortostreĉoj okupu emfazitan lokon kadre de planata Universitato de Unnuĝintaj Nacioj (la rezidejo verŝajne estos en Tokio) inter la "premaj tutmondaj problemoj de homa pluvivado, evoluado kaj bonfarto" tiel nomataj laŭ la Ĉarto de tiu ĉi Universitato. Temas antaŭ ĉio pri la ekkono de bazaj nutraj bezonoj en la dieto de homoj, kiuj loĝas en diversaj regionoj kun variaj klimatoj, altitudoj kaj ĉirkaŭaĵoj, kaj pri la aplikado de la scio al praktikaj demandoj, kiujn frontas la homoj ĉiutage.

Estas sciate, ke la malsatado nuntempe havas plejofte ne kvantan, sed specialan, kvalitan karakteron, do fontas el parta manko de gravaj por la sano komponantoj, precipe el tiu de la proteinoj.

Ĉar ĉiaspeca orientiĝo kaj praktika aplikado koncerne la protein-problemon baziĝas sur detala ekzamenado de nutraĵ-proteinoj rilate al la procenta enhavo, kemia konsisto kaj biologia valoro, mi opinias ke estos interese mallonge trarigardi la ĉefajn analizmetodojn el nutradologia vidpunkto kaj kelkajn koneksajn demandojn.

Antaŭ ĉio jen kelkaj bazaj scioj pri nutraĵproteinoj:

La proteinoj estas — kiel konate — nitrogenhavaj organikaj kombinaĵoj kun molekula maso inter kelkmil kaj plurmilionoj. La konstruadon de tiuj makromolekuloj partoprenas ĝenerale 20 "konstru-brikoj", aminoacidoj, jenaj:

alanino (ALA)fenilalanino (FE)izoleŭcino (ILEU)serino (SER)
arginino (ARG)glicino (GLI)leŭcino (LEU)tirozino (TIR)
asparaginacido (ASP)glutaminacido (GLU)lizino (LIZ)treonino (TRE)
asparagino (ASN)glutamino (GLN)metionino (MET)triptofano (TRI)
cisteino (CIS)histidino (HIS)prolino (PRO)valino (VAL)

La ĝenerala formulo de aminoacidoj estas:

Ĉiu aminoacido havas amfoteran karakteron; pro aminogrupo (—NH2) ĝi estas bazo, kaj pro karboksil-grupo (—COOH) acido. Per tiuj du grupoj ligiĝas la aminoacidoj, formante t.n. peptid-ligojn (—CO—NH—) kaj estigas pli malpli longajn polipeptidajn ĉenojn:

2. Analizmetodoj por determino de la kemia konsisto de proteinoj

Ĉar la procenta enteno de la nutraĵo je proteinoj povas esti tre diversa (v. tab. 2), la unua paŝo ĉe la analizo ĝenerale estas la determino de la tuta protein-enhavo. La analizisto uzas por tiu celo plejofte iun freŝdatan varianton de la klasika metodo de Kjeldahl (1883). Tiu metodo baziĝas sur la fakto, ke el organikaj kombinaĵoj, enhavantaj nitrogenon — okaze de ilia malkomponado per varmega, koncentrita sulfuracido — la ligita nitrogeno reduktiĝas al amoniako, kaj tiu ligiĝas kun la superabunda sulfuracido je nevolatila amoniosulfato (H4N)2SO4. El tiu kombinaĵo amoniako estas liberigebla per forta lesivo (kutime NaOH), kaj estas transdistilebla en precize konatan kvanton da acido; ties superabundon oni reentitras.

La prikalkulado baziĝas sur la ĝenerale akceptita supozo, ke la enhavo de protein-miksaĵo je nitrogeno estas 16%. Sekve, se oni multobligas la nitrogen-enhavon per la faktoro (100/16 =) 6,25; oni ricevas la tutan protein-entenon de la provaĵo.

En certaj okazoj povas esti necese ekstrakti la tuton de proteinoj el nutraĵoj kaj apartigi la unuopajn komponantojn. Ĉi tiun procedon antaŭas dispecetigo kaj homogenigo de la provaĵo; oni frakasas la ĉelojn plejofte per alterna frostigo kaj degeligo, aŭ per ultrasono. Poste sekvas la desolvo kaj divido en frakciojn, kelkfoje ankoraŭ laŭ la klasika metodo de Osborne (1907) surbaze de la solvebleco. Laŭ tiu distingiĝas la konataj grupoj: albuminoj (solveblaj en akvo, diluitaj salsolvaĵoj, acidoj kaj lesivoj), globulinoj (nesolveblaj en akvo, jes en diluitaj salsolvaĵoj, acidoj kaj lesivoj), glutelinoj (nesolveblaj en neŭtralaj solviloj, jes en diluitaj acidoj, lesivoj), prolaminoj (solveblaj en 50-90%-a alkoholo), kaj skleroproteinoj (nesolveblaj). Menciindas, ke sur la solveblecon grave efikas temperaturo kaj pH.

Ĝisdata procedo por frakcii proteinojn en komponantojn estas la t.n. jon-interŝanĝa kromatografio (v. sube).

Por esplori la kemian konsiston de proteino aŭ -miksaĵo, oni devas malkombini ĝin per hidrolizo, ĝis la "konstrubrikoj", aminoacidoj. Al tiu celo servas acidoj, lesivoj aŭ enzimoj. En la praktiko oni plejofte uzas 20%-an kloridan acidon, kaj varmigas la protein-miksaĵon kun la acido dum 18-24 horoj. Per tiu ĉi longa acid-efiko kelkaj aminoacidoj (precipe triptofano) difektiĝas. Se gravas, precize determini ties kvantojn, oni aplikas paralele ankaŭ aliajn oportunajn metodojn. — La superfluan acidon oni forpelas per ripetita distilado en vakuo. La postrestinta seka substanto servas kiel bazmaterialo por la analizo.

La analizado de aminoacidoj nuntempe okazas plej ofte per kromatografio, kiu estas unu el la plej elstaraj plenumaĵoj de la analiza kemio.

La principo de kromatografio estas jena: Komponantoj de miksaĵo, inversigeble ligitaj al (plejofte solida) portilo (stabila fazo) postrestas sur ĝi en individue diversa grado, se trafluas ĝin solvilo, eluanto (mobila fazo), sekve disiĝas je apartaj makuloj.

La plej konata varianto de la metodo baziĝas sur la diversa adsorbopovo de komponantoj. Tiel apartigis la ellaborinto Cvet (1906) vegetalajn kolorigilojn sur kolonoj el pulvoro de alumino (A12O3).

Tamen, por hidrofilaj (en akvo solveblaj) substancoj, kiaj estas la aminoacidoj, plie taŭgas la paperkromatografio (Consden, Gordon, Martin 1944). Ĉi tie la stabilan fazon reprezentas la papero, pli precize tegaĵo el hidratoj (do akvo), elformiĝinta ĉirkaŭ la (celulozo)-molekuloj de la papero. Sekve, la aminoacidoj dividiĝas — laŭ sia materiala kvalito — inter du likvaj fazoj.

La tekniko estas simpla. Oni uzas striojn de filtropapero. Proksime al unu ekstremo oni surmetas gluteton da apartigenda hidrolizaĵo. Post sekiĝo de la guteto oni permesas al konvena solvilo (ekz. miksaĵo el n-butanolo, aceta acido kaj akvo 4:1:5) sorbiĝi de tiu ekstremo en la paperon kaj kuri kiel mobila fazo ĝis certa distanco. Poste oni sekigas la paperon, kaj por riveli (videbligi) la kromatogramon, oni aspergas ĝin per reakciilo, oportune per diluita solvaĵo de ninhidrino. Post varmigo, la aminoacidoj aperas kiel bluetaj-violaj makuloj sur la papero, liverante unudimensian kromatogramon (ĉar la mobila fazo kuris en nur unu direkton).

Plialtigi la disig-povon oni povas helpe de kromatogramo du-dimensia, nome tiel, ke oni turnas la paperon post la sekiĝo (sed antaŭ la rivelo) je 90 gradoj kaj kurigas alian solvilon tra ĝi. Post denova sekiĝo sekvas la rivelo. Tiamaniere eĉ 20 aminoacidoj estas disigeblaj.

Fig. 1: Dudimensia paperkromatogramo
de aminoacidoj.

La paperkromatografio ebligas ne nur identigon de la unuopaj komponantoj, sed ankaŭ taksadon de kvantaj valoroj, surbaze de grandeco aŭ intenso de la makuloj, aŭ mikroanalizo de substancoj, el ili desolvitaj.

Por rapida identigo kaj taksado oni prefere laboras per kromatografio sur minca tavolo (Stahl 1958): Surglaso-plato oni preparas mincan (ĉ. 250&nucro; m-ojn dikan) tavolon el taŭga, plejofte neorganika adsorbilo. Aplikante la teknikon de dividiĝo inter du likvaj fazoj (stabila fazo estu hidrat-tegaĵo) oni pretigas bonkvalitan kromatogramon — anstataŭ dum pluraj horoj — dum 15-20 minutoj.

Por kvante, precize determini la ĉeestantajn en hidrolizaĵo aminoacidojn, oni ĝenerale laboras per jon-interŝanĝa kromatografio. Ĉi tie la stabila fazo plejofte konsistas el plasto, ekz. artefarita rezino, kiu entenas acidajn (katjon-interŝanĝajn) aŭ bazajn (anjon-interŝanĝajn) grupojn, enkondukitajn per kemia procedo. Per tiu — kutime granulforma — portilo oni plenigas kolonon, poste malrapide tralasas solvaĵon, kiu enhavas la aminoacidojn. Tiuj kemie, salece ligiĝas al la portilo, laŭ sia elektra ŝargo. Se oni antaŭe acidigis la solvaĵon, kiel kutime ĉe aminoacidoj, ĉi tiuj ligiĝas kiel katjonoj. Nun sekvas la eluado (tralavo per mobila fazo), plejofte per plialtigo de pH. En ties daŭro laŭvice liberiĝas la acidaj, neŭtralaj kaj bazaj aminoacidoj, aperas ĉe la malsupra finaĵo de la kolono kaj kolektiĝas en aŭtomataj frakcio-kolektiloj. Aldonante reakciilon (ninhidrinon), oni determinas la koncentritecon kolorimetrie.

Se la primara celo ne estas kompleta analizo, sed determino de nur unu aŭ kelkaj aminoacidoj, ankaŭ mikrobiologiaj metodoj povas fari valorajn servojn. Ili baziĝas sur la biologia efiko de la determinenda substanco. Nome, por la vivaktiveco de kelkaj mikroboj (bakterioj, fungoj, protozooj), certaj aminoacidoj, vitaminoj kaj aliaj kombinaĵoj estas bezonataj. La principo de analizo: Se iu inter la substancoj, nemalhaveblaj por la test-tribo mankas el la nutra medio, ĝenerale tute ne okazas kreskado. Aldono de la mankanta komponanto — en pliiĝanta kvanto ĝis la optimumo — kondukas al proporcie ĉiam pli intensa evoluo, mezurebla per acidometrio, turbidimetrio aŭ alimaniere. El la akiritaj indikoj konstrueblas kalibra kurbo, de kiu la kvanto de la determinenda efikilo estas rekte legebla.

3. La determinado de la biologia valoro.

Biologia valoro nomiĝas la procenta utiligo de la nitrogeno, alprenita per la nutraĵo. La procedoj, ellaboritaj por ĝia determinado, estas metodoj kemiaj aŭ "en vivo".

1) La kemiaj metodoj baziĝas sur la enhavo de aminoacidoj. Jen kelkaj karakterizaj variantoj:

Ĉiuj tiuj du lastaj kalkuladoj akordiĝas kun esplorrezultoj, laŭ kiuj ne nur la esencaj aminoacidoj havas efikon sur la biologian valoron, sed ankaŭ aliaj aminoacidoj (v. sube).

2) La metodoj "en vivo" baziĝas ĉefe sur mezurado de la metabolo de vivaj organismoj, plejofte de ratoj aŭ porkoj, kelkfoje de hundoj aŭ kortobirdoj. Remaĉuloj ne taŭgas por tiaspecaj eksperimentoj pro la granda diferenco de sia digesta sistemo. Ĉi tie menciindas ankaŭ la metodoj utiligantaj la metabolon de mikroboj.

La plej gravaj kriterioj de la pritaksado de nutra valoro "en vivo" estas jenaj:

— la N-bilanco (nitrogen-bilanco); laŭ ekvacio de FAO (1957)
B = a — (u + f) kie a .. alpreno de N
u .. urino
f .. fekaĵo

Se malpli da nitrogeno ekskreciĝas ol iĝas alprenita, la N-bilanco estas pozitiva. Ju pli bone iu nutraĵo-proteino kontentigas la bezonojn de organismo, des pli malgranda estas la kvanto per kiu la bilanco egaliĝas.

Sur la mezurado de la N-bilanco baziĝas pluraj gravaj metodoj kaj variantoj.

— La kreskado estas bone aplikebla kriterio ĉe junaj organismoj; ankaŭ ĝin utiligas pluraj variantoj.

Ekz. ĉe determino de la relativa kreskada kurbo (Hegsted kaj Chang Yet 1965) kurboj estis konstruitaj, montrantaj la kreskadon de bestoj (ratoj), nutritaj per diversaj test-proteinoj, kaj poste komparitaj kun similaj kurboj konstruitaj por bestoj, nutritaj per plenvalora proteino (albumino). Se la nutran valoron de ĉi-lasta oni prenis 100%, la biologia valoro de kazeino pruviĝis por ili 70%, tiu de sojoproteino 33,7 kaj tiu de la tritiko-gluteno 21,8%.

El inter mikroboj la plej ofte aplikitaj test-triboj estas bakterioj, ĉefe pro la relativa rapideco de ilia kulturado. Kaŭzas tamen iom da malfacilaĵo la fakto, ke la proteinojn ekzamenendajn pri kvalito, aldonitajn en la nutran medion, oni devas en ĉiu okazo prehidrolizi per enzimoj "en vitro", krome, eventuale kompletigi la nutran medion per aliaj, por la bakterio bezonataj aminoacidoj. Ekz. la test-tribo Leuconostoc mesenteroides P60 bezonas krom ĉiuj, por la homo esencaj aminoacidoj ankoraŭ 8 aliajn por sia evoluo. Kiel mezuro de la bakteria kreskado servas la laktoacido, produktita dum ĝia metabolo. Oni komparas la ricevitajn indikojn kun tiuj de plenvalora fonto (Nehring kaj Wünsche 1959).

Elstarajn proprecojn havas la protozoo Tetrahymena pyriformis kaj precipe ties tribo W. (Rosen k.a. 1958; Teunison 1961). Ĝi bezonas la samajn esencajn aminoacidojn, kiel la homo, ĝi posedas eksterĉelajn proteinazojn, per kiuj ĝi memstare hidrolizas la proteinojn, aldonitajn en la nutran medion, krome, ĝia kreskado estas proporcia al la nutra valoro de proteinoj, ĝi eĉ estas sentiva al ties difekto pro teknologiaj kaŭzoj. Tamen, pro la ege komplika kaj longdaŭra bredado kaj mezurado, la metodo nur malofte estas uzata en laboratorioj. Antaŭ ol kompari la metodojn per kies helpo eblas determini aŭ taksi la kvaliton de proteinoj, ni devas okupiĝi pri kelkaj faktoroj, kiuj pli malpli grave povas efiki sur la nutran valoron, ties mezuradon kaj prijuĝon:

La teknologio povas efiki avantaĝe kaj malavantaĝe sur la nutran valoron. Kuireja varmigo ĝenerale plialtigas la digesteblecon, sed varmigo ĉe pli alta temperaturo, precipe per seka varmo plejofte malutilas, kaŭzas perdojn je esencaj aminoacidoj. Koncerne la lizinon oni supozas, ke ĝia t.n. Σ-aminogrupo

reagas kun —CO— grupo aŭ aliaj aktivaj grupoj, kaj elformiĝas kombinaĵoj rezistaj al digestaj enzimoj, sed ne al acidoj; do tiu difekto ĝenerale ne malkovriĝas.

Sur tiu supozo baziĝas sprita kemia metodo pri taksado de la protein-kvalito per determino de la "disponebla lizino" (Carpenter kaj Ellinger 1955). Ĝi utiligas la fakton, ke nur lizinmolekuloj kun reagemaj Σ-grupoj, do valoraj el nutra vidpunkto, formas koloran kombinaĵon kun la reackiilo fluoro-dinitro-benzeno (FDNB), kolorimetrie mezureblan post hidrolizo per acido.

Superrigardante la metodojn pri la determino de la kvalito de nutraĵo-proteinoj, oni povas konstati jenon:

La kemiaj metodoj havas la avantaĝon de relativa simpleco kaj rapideco, sed la malavantaĝon, ke ili ne konsideras, ĉu la organismo vere povas utiligi la aminoacidojn tiom, kiom rezultas el la diversaj kalkuladoj.

La biologiaj metodoj evitas ĉi tiun malavantaĝon, sed estas pli komplikaj kaj longdaŭraj. Inter ili plej fidindaj estas la metodoj, per kiuj mezureblas la N-bilanco, kvankam ankaŭ ili dependas en certa grado de provizore ne ĉiam precize kalkuleblaj faktoroj, precipe de la diferencoj inter la protein-utiligo de la test-organismo kaj la homo.

Laŭ ĝenerala praktiko de la lastaj jaroj oni kutimas kombini metodojn kemiajn kaj "en vivo", pritaksante la nutran valoron surbaze de ambaŭ. Tio estas ege longdaŭra procedo.

Resume estas konstateble, ke por determino de la kemia konsisto de proteinoj la analizisto disponas pri pluraj rapidaj kaj precizaj metodoj, sed por ekzamenado de la biologia valoro ankoraŭ ne. El tiu situacio sekvas primara tasko de esploristoj: ellabori laŭeble simplajn rapidajn, por ĉiutaga rutinlaboro taŭgajn analizmetodojn, surbaze de kiuj oni fidinde povu determini la kvaliton de proteinoj en niaj nutraĵoj.

4. Literaturo
5. Glosaro
nutradologionutradscienco, branĉo de la nutraĵo-scienco.
fenilalaninoaminociado C6H5 CH2NH2—COOH esenca

konstrubriko

de

la

organismo
izoleŭcinoaminoacido (CH3)2CH2CHCHNH2COOH
lizinoaminoacido CH2NH2(CH2)3CHNH2COOH
metioninoaminoacido CH3S(CH2)2 CHNH2COOH
treoninoaminoacido CH3CHOH CHNH2COOH
valinoaminoacido (CH3)2 CHCHNH2COOH
argininoaminoacido COOH CHNH2 (CH2)2 CH2 NH CNH NH2
asparaginacidoaminoacido COOH CH2CHNH2COOH
asparaginoaminoacido CONH2 CH2 CHNH2COOH
glutaminacidoaminoacido COOH(CH2)2CHNH2COOH
glutaminoaminoacido COOH (CH2)2CHNH2CONH2
histidinoaminoacido C6 H9 N3 O2 heterocikla derivaĵo de alanino
serinoaminoacido CH2 OH—CHNH2 COOH
glutelinojgrupo de proteinoj, trovigantaj en cerealoj; apud la prolaminoj,
ĉefaj komponantoj de gluteno
ninhidrinosenkolora, kristala kombinaĵo C9H6O4, estiganta kun proteinoj,
polipeptidoj kaj aminoacidoj karakterizan kolorreakcion
acidometriomezurado de koncentriteco de acido
turbidimetriomezurado de malklaraĵo en likvaĵo

A fehérjék analiziséről táplálkozástani szempontból

Korunkban világszerte súlyos gondot jelent a táplálkozástani szempontból értékes fehérjékkel való hiányos ellátottság. Az alapvető táplálkozási szükségletek átfogó felmérése a szerzett ismeretek gyakorlati alkalmazása céljából — lesz egyik kiemelt feladata egy felállításra kerülő ENSZ-egyetemnek is. Minthogy a kérdés az érdeklődés homlokterében áll, az ilyenirányu kutatásokhoz pedig nélkülözhetetlen az élelmiszerfehérjék folyamatos vizsgálata és értékelése, a szerző — tájékoztatási szándékkal — rövid áttekintést ad a jelenleg alkalmazott főbb vizsgálati módszerekről és az ezekkel kapcsolatos egyes problémkákról.

Bevezetőből néhány alapfogalmat tárgyal és táblázatosan mutat be adatokat az esszenciális aminósavakra vonatkozólag, szükséges mennyiségüket az emberi szervezet számára, tényleges mennyiségüket néhány fontosabb élelmiszerben. Ezután rátér a kémiai öszetétel vizsgálatára, foglalkozik az összfehérjetartalom meghatározása, a frakcionálás, a hidrolízis alapelveivel, az aminósavak meghatározásának gyakoribb, elsősorban kromatográfiás változataival A harmadik részben a biológiai érték meghatározásának alapelveit tárgyalja: kémiai eljárások és "en vivo" módszerek csoportosításban, utóbbiba beleértve a mikrobiológiai elemzést is. Külön foglalkozik azokkal a tényezőkkel, amelyk kisebb-nagyobb mértékben befolyásolhatják a kísérleti eredményeket.

Vegül egybevetve a fehérjeminőség értékelésére szolgáló módszereket megállapítja, hogy ebben a vonatkozásban egyik legfontosabb .kutatási feladat olyan egyszerű, gyors, rutinvizsgálati módszerek kidolgozása, amelyek a biológiai érték meglehetős pontossággal való meghatározására alkalmasak.


Fonto: SCIENCA REVUO, vol. 29 (1978), n-ro2 (130) pp. 61-70

STEB: http://www.eventoj.hu

Reen al la antaŭa paĝo!